第三章酶的生物合成與發酵生產

1酶的生產方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample核糖核酸酶2本章內容第一節酶生物合成及調節第二節酶發酵動力學第三節微生物發酵產酶第四節動、植物細胞培養產酶3Reversetranscription

第一節酶生物合成及調節一、酶的生物合成

遺傳信息傳遞的中心法則4Replication復制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。Transcription轉錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。Translation翻譯：以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質的AA順序的過程。Reversetranslation逆轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，生成DNA的過程。5（一）RNA的生物合成--轉錄(transcription).1.細胞內RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。(2)在蛋白質的生物合成過程中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質合成的模板，由其分子上的三聯體密碼控制蛋白質分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質生物合成的場所。6(3)某些RNA具有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關的生化反應。(4)各種小分子RNA在分子修飾和代謝調節等方面有重要作用。2.轉錄：

以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。7轉錄模板啟動子（promotor)

終止子(terminator)模板鏈（templatestrand）反意義鏈(antisensestrand)編碼鏈(codingstrand)有意義鏈(sensestrand)DNA5′5′3′3′反意義鏈:指導轉錄作用的一條DNA鏈有意義鏈:無轉錄功能的一條DNA鏈.8轉錄過程的特點（1）轉錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉錄的模板，稱為轉錄的不對稱性。反義鏈antisensestrand（無意義鏈，負鏈）：在RNA的轉錄中，用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈codingstrand（編碼鏈，正鏈）：在RNA的轉錄中，不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。9（2）轉錄所需酶：依賴DNA的RNA聚合酶又稱為轉錄酶，是以DNA為模板的一類RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，轉錄酶有所不同。原核生物的轉錄酶比較簡單，由1種RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3種，分別為RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它們都屬于寡聚酶，酶的亞基數目為4～10個，亞基種類有4～6種。10TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意義鏈反意義鏈RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’11

原核生物的RNA聚合酶(DDRP)

E.coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（2）

起始因子12RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區到達基因終點延長階段53RNA

啟動子（promotor)

終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開13RNA鏈的延伸圖解3′5′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動方向新生RNA復鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位14翻譯:以RNA中mRNA為模板,按照其核苷酸順序所組成的密碼指導蛋白質的合成的過程.mRNA蛋白質翻譯各種信息各種蛋白質（核苷酸排列順序）（氨基酸排列順序）（二）蛋白質的生物合成--翻譯(translation)

15蛋白質的合成過程

（大腸桿菌）氨基酸的活化肽鏈合成的起始肽鏈的延伸肽鏈合成的終止與釋放

蛋白質前體的加工16氨基酸的活化與轉運反應式：AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi對于E.coli而言，肽鏈合成時的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。17在核糖體上合成多肽（三階段）1、起始階段2、延伸階段3、終止階段18原核生物肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子（InitiationFactor）的參與下，核糖體30S亞基，fMet-tRNAF，mRNA和50S亞基結合，組成起始復合物的過程。主要包括5個步驟：（1）30S亞基與起始因子IF3結合；（2）30S亞基與mRNA結合，形成30S-IF3-mRNA復合物；（3）fMet-tRNAF與起始因子IF2以及GTP結合，生成fMet-tRNAF-IF2-GTP；肽鏈合成的起始階段19（4）在起始因子IF1的參與下，fMet-tRNAF-IF2-GTP與30S-IF3-mRNA結合生成30S起始復合物。在此30S起始復合物中，fMet-tRNAF上的反密碼子正好與mRNA上的起始密碼子AUG結合；（5）50S亞基與上述30S起始復合物結合，形成完整的70S核糖體。同時放出IF1，IF2，IF3，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70S核糖體形成時，fMet-tRNAF位于70S核糖體的“P”位（肽?；唬?，而它的“A”位（氨?；唬┦强瘴弧?0AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亞基mRNA蛋氨酰tRNA+GTP+IF2大亞基GDP+Pi受位給位蛋蛋肽鏈合成的起始階段IF3IF3IF121肽鏈合成的延伸階段1.進位:氨基酰-tRNA進入受位;2.轉肽:形成肽鍵,在轉肽酶作用下,給位與受位結合;3.移位:核蛋白體向3’端移動一個密碼子的位置,空出受位,不斷地進位、轉肽、移位,使肽鏈延長。22AUGACA5’3’UAC蛋蘇UGUAUGACA5’UAC蛋蘇UGUGUUAUGACA5’UAC蛋蘇UGUGUUAUGACA5’蛋蘇UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始復合體進位轉肽移位Mg+K+23肽鏈合成的終止階段1.出現終止密碼并與終止因子結合;2.肽鍵水解,多肽釋放;3.tRNA,mRNA,大小亞基解離.

24AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’終終AUGUAA5’UAC3’終5’3’UAC終肽鏈2526蛋白質前體的加工N端fMet或Met的切除二硫鍵的形成特定氨基酸的修飾切除新生肽鏈中的非功能片段肽鏈的折疊亞基的聚合27二、酶生物合成的調節定義：通過調節酶合成的量來控制微生物代謝速度的調節機制，是在基因轉錄水平上進行的。意義：通過阻止酶的過量合成，節約生物合成的原料和能量。28操縱子——基因表達的協同單位操縱子結構基因（編碼蛋白質,structuralgene,S）控制部位操縱基因（operatorgene,O）啟動子（promotorgene,P）（一）基因調控理論

JacobandMonod的操縱子學說（operontheory）

29基因操縱子調節系統示意圖

調節基因

啟動基因操縱基因結構基因

DNA

轉錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質

誘導劑

控制區信息區操縱子30

調節基因(regulatorgene)：

可產生一種組成型調節蛋白(regulatoryprotein)（一種變構蛋白），通過與效應物(effector)（包括誘導物和輔阻遏物）的特異結合而發生變構作用，從而改變它與操縱基因的結合力。調節基因常位于調控區的上游。31cAMP-CRP復合物的作用示意圖

啟動基因（promotorgene）（啟動子）：有兩個位點：

（1）RNA聚合酶的結合位點（2）cAMP-CAP的結合位點。CAP：分解代謝產物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又稱環腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP復合物結合到啟動子的位點上，RNA聚合酶才能結合到其在啟動子的位點上，酶的合成才能開始。

32操縱基因（Operatergene）:

位于啟動基因和結構基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調節基因產生的變構蛋白結合，操縱酶合成的時機與速度。結構基因（Structuralgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對應關系，其中的遺傳信息可轉錄為mRNA，再翻譯為蛋白質。33(二)酶合成調節的類型

1.誘導

(induction)

組成酶：細胞固有的酶類。誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似物而臨時合成的一類酶。

2.阻遏(repression)分解代謝物阻遏(cataboliterepression)反饋阻遏(feedbackrepression)34（三）酶合成的調節機制

1.酶合成的誘導

加進某種物質，使酶生物合成開始或加速進行。酶合成誘導的現象：

已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。35實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養基上時，細胞內無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長在乳糖培養基上時，細胞內有上述三種酶合成；（3）表明菌體生物合成的經濟原則：需要時才合成。36調節基因操縱基因乳糖結構基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因關閉啟動子ORPLacZLacYLaca調節基因操縱基因乳糖結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（無活性）基因表達mRNAA、乳糖操縱子的結構

B、乳糖酶的誘導

乳糖阻遏蛋白（有活性）誘導作用372.產物阻遏（反饋阻遏）

由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏。

酶合成阻遏的現象：

實驗：

（1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養基上時，檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養基中加入色氨酸，檢測發現細胞內色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現了菌體生長的經濟原則:不需要就不合成。38色氨酸操縱子——酶的阻遏調節基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達調節基因操縱基因結構基因輔阻遏物代謝產物與阻遏蛋白結合，使之構象發生變化與操縱基因結合，結構基因不能表達39酶的誘導和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動基因調節基因結構基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結構基因不表達誘導物誘導物與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結構基因可以表達酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結合,結構基因可以表達阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表達代謝產物40調控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結合阻遏效應舉例酶的誘導有活性－＋不轉錄，繼而不翻譯誘導物－轉錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導與阻遏操縱子模型調控作用對比413.分解代謝物阻遏指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。42分解代謝物阻遏現象：實驗：細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養基上生長，優先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產生了兩個對數生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現象”(diauxie或biphasicgrowth）。這一現象又稱葡萄糖效應，產生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調節基因的產物是環腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白(CAP)。43分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達CAP基因結構基因TCAPOCAP結合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產物腺苷酸環化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態44

第二節酶發酵動力學

一、細胞生長動力學

在分批培養(batchculture)過程中，細胞生長一般要經歷延遲期、指數生長期、減速期、靜止期和衰亡期5個階段。45

細胞生長曲線O-A延遲期A-B指數生長期B-C減速期C-D靜止期D-E衰亡期

46

營養物濃度（生長限制基質濃度）和生長速率之間的動力學關系：Monod模型μ:比生長速率（1/h）（specificgrowthrate）μmax：最大比生長速率（1/h）S：營養物濃度（生長限制基質濃度）克/LKs：莫諾德常數或飽和常數或營養物利用常數克/L，或mol/L471前提：假設培養基中只有一種限制性基質，而不存在其他生長限制因素時，比生長速率為這種限制性基質濃度的函數。2當S>>Ks時，μ=μmax。3Ks為莫諾德常數，是指比生長速率達到最大生長速率一般時的限制性基質濃度。即，當μ=0.5μmax時，S=Ks。Monod模型4849

二、產酶動力學

（一）酶生物合成的模式

根據酶的合成與細胞生長之間的關系，可將酶的生物合成分為3種模式，即：

同步合成型生長偶聯型——中期合成型部分生長偶聯型——延續合成型非生長偶聯型——滯后合成型501.生長偶聯型（又稱同步合成型）酶的生物合成與細胞生長同步。特點：酶的合成可以誘導，但不受分解代謝物阻遏和反應產物阻遏。當去除誘導物、細胞進入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對應的mRNA很不穩定。51生長偶聯型中的特殊形式——中期合成型

酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：酶的合成受產物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏。所對應的mRNA是不穩定的。

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

522.部分生長偶聯型（又稱延續合成型）

酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續合成較長一段時間。特點：可受誘導，一般不受分解代謝物和產物阻遏。所對應的mRNA相當穩定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線533.非生長偶聯型（又稱滯后合成型）

只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物的阻遏作用。所對應的mRNA穩定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線

54總結：影響酶生物合成模式的主要因素1）mRNA的穩定性高：可在細胞停止生長后繼續合成酶差：隨著細胞停止生長而終止酶的合成2）培養基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細胞的生長而開始酶的合成。受阻遏：細胞生長一段時間或平衡期后，酶才開始合成。55

酶生產中最理想的合成模式：延續合成型：發酵過程中沒有生長期和產酶期的明顯差別。細胞開始生長就有酶的產生，直至細胞生長進入平衡期后，酶還可以繼續生成一段時間。

對于：同步合成型：提高對應的mRNA的穩定性，如降低發酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩定性以及解除阻遏兩方面努力。56(二)產酶動力學一般產酶動力學方程可表達為：式中X——細胞濃度(g/L)

——細胞比生長速率(h-1) ——生長偶聯的比產酶系數(IU/g) ——非生長偶聯的比產酶速率(IU/(gh))E——酶濃度(IU/L)t——時間(h)57生長偶聯型部分生長偶聯型

非生長偶聯型

58第三節微生物發酵產酶一、產酶微生物的分離和選育1.優良產酶菌種應具備的條件（1）酶產量高（2）易培養（生長速率高、營養要求低）（3）遺傳性能穩定，不易退化（4）易分離提純（5）安全可靠（不是致病菌）592.常用的產酶微生物EscherichiacoliPseudomonas(假單胞菌)

Bacillussubtilis（枯草桿菌）MicrococcusStreptococcus(鏈鎖狀球菌

)Streptomyces(鏈霉菌

)Aspergillusniger（黑曲霉）Aspergillusoryzae(米曲霉

)Monascus(紅曲霉)Penicillium(青霉

)Trichoderma(木霉

)Rhizopus(根霉

)Mucor(毛霉

)Absidia(犁頭霉

)

Saccharomycescerevisiae

Candida(假絲酵母

)60(1)大腸埃希氏桿菌，簡稱為大腸桿菌，是最為著名的原核生物。形態：短桿或長桿狀，0.5～1.0×1.0～3.0um，革蘭氏陰性，運動(周毛)或不運動，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴展，光滑，閃光。大多數大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌的名聲主要因它易于在實驗室操作、生長迅速，而且營養要求低。61應用： 大腸桿菌能作為宿主供大量的細菌病毒生長繁殖 大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌

工業上生產谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等62(2)醋酸桿菌（Acetobacter）

菌體從橢圓至桿狀，單個、成對或成鏈，革蘭氏陰性，運動（周毛）或不運動，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養基上生長良好。應用：有機酸(食醋等）葡萄糖異構酶(高果糖漿)山梨糖(維C中間體）63(3)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）

直狀、近直狀的桿菌，周生或側生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生?？莶菅挎邨U菌是工業發酵的重要菌種之一。生產淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。64(4)根霉(Rhizopus)分類學上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養基上固著，并吸收營養）。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質和水果、蔬菜的腐爛。代表種：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。65應用：根霉能產生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產這些酶類的菌種。在釀酒工業上常用做糖化菌。有些根霉還能產生乳酸、延胡索酸等有機酸66(5)曲霉(Aspergillus)

分類：多數屬于子囊菌亞門，少數屬于半知菌亞門。分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質，有的可產生致癌性的黃曲霉毒素。代表種：黑曲霉Asp.Niger黃曲霉Asp.flavus67應用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產有機酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農業上用作生產糖化飼料的菌種。683.產酶微生物的分離和篩選

1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場所采集樣品2)富集培養:投其所好，取其所抗3)分離獲得微生物的純培養（pureculture）。4)初篩：選出產酶菌種，以多為主。5)復篩：選出產酶水平相對較高的菌株，以質為主。

69

-淀粉酶的篩選70蛋白酶產生菌的獲得方法應用含酪蛋白的培養基714.產酶微生物優良菌種的選育

誘變育種原生質體融合育種基因工程育種72

二.微生物發酵產酶方法

1.固體培養:特別適合于霉菌培養2.液體培養:目前酶發酵生產的主要方式3.固定化細胞:需要特殊的固定化細胞反應器

73三.微生物酶的類型

1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環境中的大分子而釋放到細胞外的，即使胞外濃度很高，胞內也能維持較低水平，受到的調節控制少。2.胞內酶：指合成后仍留在細胞內發揮作用的酶，酶活性和濃度受到中間產物和終產物的調控。74四、酶發酵生產的一般工藝流程

75五、酶的發酵工藝條件與控制1、培養基2、發酵條件及控制3、提高產酶的措施761、培養基各種生物對營養的需求771、選擇適宜的營養物質2、營養物的濃度及配比合適3、物理、化學條件適宜4、經濟節約5、精心設計、試驗比較培養不同的微生物必須采用不同的培養條件；培養目的不同，原料的選擇和配比不同；不同階段，培養條件也有所差異。培養基的設計原則任何培養基都應該具備微生物生長所需要五大營養要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水。78實驗室的常用培養基：細菌：牛肉膏蛋白胨培養基（或簡稱普通肉湯培養基）；放線菌：高氏1號合成培養基培養；酵母菌：麥芽汁培養基；霉菌：查氏合成培養基；例如枯草芽孢桿菌：一般培養：肉湯培養基或LB培養基；自然轉化：基礎培養基；觀察芽孢：生孢子培養基；產蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產酶培養基。792、發酵條件及控制培養基的pH必須控制在一定的范圍內，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產生代謝產物。為了維持培養基pH的相對恒定，通常在培養基中加入pH緩沖劑，或在進行工業發酵時補加酸、堿。通常培養條件：細菌與放線菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范圍內生長（1）pH值的控制80細胞發酵產酶的最適pH值與生長最適pH值往往有所不同。細胞生產某種酶的最適pH值通常接近于該酶催化反應的最適pH值。

有些細胞可以同時產生若干種酶，在生產過程中，通過控制培養基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產量比例。81枯草桿菌堿性磷酸酶酶作用最適PH9.5,產酶最適PH7.4黑曲霉PH偏中性，淀粉酶產量增加，糖化酶減少PH偏酸性，淀粉酶產量減少，糖化酶增加米曲霉PH偏堿性，生產堿性蛋白酶PH偏中性或酸性，生產中性或酸性蛋白酶82通常在生物學范圍內每升高10℃，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應，對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。（2）溫度的控制有些細胞發酵產酶的最適溫度與細胞生長最適溫度有所不同，而且往往低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對應的mRNA的穩定性，增加酶生物合成的延續時間，從而提高酶的產量?？莶輻U菌的最適生長溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長溫度為28～32℃83醬油曲霉生產蛋白酶，28℃下發酵，其蛋白酶的產量比在40℃下提高2-4倍，在20℃下更高。但并不是溫度越低越好，若溫度過低，生化反應速度很慢，反而降低了酶產量，延長發酵周期。因此必須進行試驗，以確定最佳的產酶溫度。84發酵初期——合成——吸熱——保溫旺盛期——分解——放熱——降溫排管、蛇管、夾套、噴淋裝置85（3）溶解氧的控制在酶的發酵生產過程中，處于不同生長階段的細胞，其細胞濃度和細胞呼吸強度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。培養液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養液的性質等有密切關系。86調節通氣量調節氧的分壓調節氣液接觸時間調節氣液接觸面積改變培養液的性質控制溶解氧方法一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養液的性質，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響。增加液層高度，增加擋板空氣分配管、攪拌873、提高酶產量的措施（1）添加誘導物對于誘導酶的發酵生產，在發酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。誘導物一般可以分為3類

酶的作用底物酶的催化反應產物作用底物的類似物88（2）控制阻遏物的濃度阻遏作用根據機理不同，可分為：產物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。1.產物阻遏作用是由酶催化作用的產物或者代謝途徑的末端產物引起的阻遏作用。2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質經過分解代謝而產生的物質）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒?、提高酶產量的有效措施。89為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應當控制培養基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環腺苷酸（cAMP）對于受代謝途徑末端產物阻遏的酶，可以通過控制末端產物的濃度的方法使阻遏解除。90（3）添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產量增加。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發酵生產中添加到培養基中。91（4）添加產酶促進劑產酶促進劑是指可以促進產酶、但是作用機理未闡明清楚的物質。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產量。產酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現在還沒有規律可循，要通過試驗確定所添加的產酶促進劑的種類和濃度。92第四節動、植物細胞培養產酶與微生物細胞相比，動物細胞和植物細胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養工藝。

93

植物、動物、微生物細胞的特性比較細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um200～3001～1010～100倍增時間/h﹥120.3-6﹥15營養要求簡單簡單復雜光照要求大多數要求不要求不要求對剪切力敏感大多數不敏感非常敏感主要產物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等94三者之間的差異主要有：植物細胞>動物細胞>微生物細胞。動物細胞、植物細胞的生產周期比微生物長。植物細胞和微生物細胞的營養要求較簡單。植物細胞的生長以及次級代謝物的生產要求一定的光照。植物細胞和動物細胞對剪切力敏感。植物、微生物和動物細胞的主要目的產物各不相同。95一、植物細胞培養產酶1.植物細胞培養的培養基特點

應用最廣的是MS培養基和LS培養基MS培養基是1962年由Murashinge和Skoog為煙草細胞培養而設計的培養基。LS培養基是在其基礎上演變而來的。96MS培養基組成:

配制1升（1000毫升）培養基時，加硝酸銨1.65克、硝酸鉀1.9克、氯化鈣0.44克、硫酸鎂0.37克、磷酸二氫鉀0.17克、碘化鉀0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸鎂22.3毫克、硫酸鋅3.6毫克、鉬酸鈉0.25毫克、硫酸銅0.025毫克、氯化鈷0.025毫克、硫酸鐵27.8毫克、蔗糖30克和瓊脂7克。需要大量無機鹽、多種維生素和植物生長激素、無機氮源、蔗糖碳源

2.培養方法：——懸浮細胞培養①細胞株的建立；外植體與愈傷組織②擴大培養；③大罐培養；97外植體的選擇：

從植株取出，經過預處理后，用于植物組織培養的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實、種子等）的片段或小塊。

從理論上講，植物細胞都具有全能性，能夠再生新植株，任何器官、任何組織、單個細胞和原生質體都可以作為外植體。

98但實際上，不同品種、不同器官之間的分化能力有巨大差異，培養的難易程度不同。為保證植物組織培養獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的。外植體首先選擇無病蟲