人工基因組的設計與合成李炳志bzli@2013-031中心法則蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制DNARNA復制2溫故知新Lac操縱子Trp操縱子3第六章

基因表達調控(二)李炳志bzli@2013-034第六章基因表達調控基本概念原核表達調控真核表達調控5根據其性質可分為兩大類：一是瞬時調控或稱為可逆性調控，它相當于原核細胞對環境條件變化所做出的反應。瞬時調控包括某種底物或激素水平升降時，及細胞周期不同階段中酶活性和濃度的調節。二是發育調控或稱不可逆調控，是真核基因調控的精髓部分，它決定了真核細胞生長、分化、發育的全部進程。真核生物基因表達調控的種類6真核生物基因組結構特點（1）基因組大，基因多，存在大量重復序列，大部分與組蛋白和非組蛋白結合在一起；（2）基因主要以單順反子形式存在；（3）多數基因是斷裂的；（4）存在基因家族；（5）基因表達的調控位點多，位置多樣化；（6）部分基因組序列存在重排、擴增、丟失等規律性變化。7真核基因表達調控的層次8真核生物基因表達調控的層次1、DNA水平調節2、轉錄水平調節3、轉錄后水平的調節4、翻譯水平調節5、翻譯后加工的調節DNA轉錄初產物RNAmRNA蛋白質前體mRNA降解物活性蛋白質DNA水平調節轉錄水平調節轉錄后水平的調節翻譯調節mRNA降解的調節翻譯后加工的調節核細胞質9

真核生物DNA水平上的基因表達調控●基因丟失基因擴增基因重排DNA甲基化狀態染色體結構●●●●10基因丟失：在細胞分化過程中，可以通過丟失掉某些基因而去除這些基因的活性。某些原生動物、線蟲、昆蟲和甲殼類動物在個體發育中，許多體細胞常常丟失掉整條或部分的染色體，只有將來分化產生生殖細胞的那些細胞一直保留著整套的染色體。目前，在高等真核生物（包括動物、植物）中尚未發現類似的基因丟失現象。細胞全能性：在多細胞生物中每個體細胞的細胞核具有個體發育的全部基因，只要條件許可，都可發育成完整的個體。11出生日期：1996年7月5日出生地點：英國愛丁堡市羅斯林研究所死亡日期：2003年2月14日死亡原因：被確診患進行性肺病后處以安樂死創造者：伊恩·維爾穆特及其領導的小組基因父親：無基因母親：一只芬蘭多塞特白面綿羊線粒體母親：一只蘇格蘭黑臉羊生育母親：另一只蘇格蘭黑臉羊子女：生育6名，存活5名12基因擴增：基因擴增是指某些基因的拷貝數專一性增大的現象，它使得細胞在短期內產生大量的基因產物以滿足生長發育的需要，是基因活性調控的一種方式。如果蠅的不切離多次復制導致的基因擴增現象。13基因組拷貝數增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的現象。基因組拷貝數增加使可供遺傳重組的物質增多，這可能構成了加速基因進化、基因組重組和最終物種形成的一種方式。發育或系統發生中的倍性增加在植物中普遍存在14多倍體的DNA含量與組織的成熟程度成正比。對于一給定的物種，C是單倍體基因組中的DNA質量。15將一個基因從遠離啟動子的地方移到距它很近的位點從而啟動轉錄，這種方式被稱為基因重排。通過基因重排調節基因活性的典型例子是免疫球蛋白結構基因的表達。基因重排：161718DNA的甲基化狀態：19甲基化酶:1、維持性甲基化酶(日常型甲基化酶)：在DNA復制時,可識別新合成的半甲基化雙鏈,并將甲基加到新鏈的非甲基化胞嘧啶上;2、從頭合成型甲基化酶：不需要甲基化的DNA模板作指導,可以直接使非甲基化的DNA甲基化20原核細胞的DNA甲基化1、限制修飾系統的甲基化（1）限制外源DNA：

限制性內切酶切斷外源DNA（保護機制）（2）保護自身DNA：通過內切酶識別位點特定堿基的甲基化保護自身DNA212、Dam甲基化（1）DNA腺嘌呤甲基化酶：識別序列GATC（2）作用：

a、錯配修復：識別母鏈，修正子鏈

b、轉錄調節：如抑制轉座酶基因的轉錄，抑制轉座22真核細胞DNA甲基化1、甲基化部位：胞嘧啶（C）5-甲基胞嘧啶（5-mC）（1）脊椎動物：5’-CG-3’

（2）植物（兩種基序）：5’-CG-3’，5’-CNG-3’23（3）CpG島：富含CpG的一段DNA，一般位于基因啟動子附近特點：

a、1~2kb；

b、位于基因5’端；

c、富含CpG二核苷酸基序24在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中CpG二核苷酸通常成串出現在DNA上，稱為CpG島252、甲基化的作用：（1）基因表達調控的一種方式（2）抑制外源基因的表達（3）抑制轉座子、反轉座子的活動263、DNA甲基化與基因表達調控

基因表達與甲基化呈負相關

DNA甲基化轉錄抑制作用機理（1）識別位點中胞嘧啶被甲基化，轉錄因子不能與其結合（2）特異性識別甲基化DNA的蛋白（如MeCP1）競爭性地抑制了轉錄因子的結合（3）DNA甲基化導致染色質結構和DNA構象的改變274、DNA甲基化與基因組印跡

（1）基因組印跡：來源于父母本的一對等位基因表達不同（如X染色體失活）（2）基因組印跡的機制--DNA高度甲基化28染色質結構影響基因轉錄常染色質（euchromatin）---基因可以轉錄，也稱活性染色質異染色質（hetrochromatin）---基因不能轉錄

活性基因置于異染色質內會失活位置效應（Positioneffect）：指基因轉移到基因組上新位置而引起基因表達的改變29異染色質化：基因組某些區域被組裝成高度壓縮的異染色質的過程巴氏小體：哺乳類雌體細胞1條X染色體異染色質化（雌性X染色體基因表達的蛋白質可能是雄性的兩倍）劑量補償：女性兩條X染色體的作用與男性一條X染色體基因產物劑量平衡的現象30活性染色質的主要特點在結構上：活性染色質上具有DNaseI超敏感位點活性染色質上具有基因座控制區活性染色質上具有核基質結合區（MAR序列）31活性染色質上具有DNaseI超敏感位點。每個活躍表達的基因都有一個或幾個超敏感位點，大部分位于基因5′端啟動子區域。32活性染色質上具有核基質結合區（matrixattachmentregion，MAR）。MAR一般位于DNA放射環或活性轉錄基因的兩端。DNA放射環：由直徑為25～30nm的DNA纖絲放射狀折疊排列成約250nm左右的染色單體絲。在外源基因兩端接上MAR，可增加基因表達水平10倍以上，說明MAR在基因表達調控中有作用。是一種新的基因調控元件。3334真核轉錄水平的調控順式調控元件(cis-regulatingelement)

啟動子、增強子、沉寂子、絕緣子、減弱子、應答元件反式作用因子(trans-actingfactor)

是通過識別和結合順式調控元件的核心序列而調控靶基因轉錄效率的一組蛋白質．

35反式作用元件的結構DNA結合結構域轉錄活化結構域結構域連接區36

轉錄因子DNA結合域幾種常見基序

鋅指(zincfinger)

螺旋-轉角-螺旋(helix-turn-helix)二聚體結構域：

螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix，HLH)

亮氨酸拉鏈(Leucinezipper) 37鋅指(zincfinger) C2H2型：由肽鏈的保守序列中的一對組氨酸和一對半胱氨酸(His2／Cys2)與鋅離子形成一個四面體結構有兩條β鏈和一個α螺旋，α螺旋區域上含有保守的堿性氨基酸，負責與DNA結合如TFIIIA、與GC盒結合的SPlC2H2型38C4型：

2對半胱氨酸(cys2／cys2)與一個鋅離子形成配位鍵，如類固醇激素受體家族

3940螺旋-轉角-螺旋(helix-turn-helix)

兩段螺旋被一短的轉角結構分開多種果蠅胚胎發生的調節蛋白，同源異型蛋白

13241亮氨酸拉鏈(Leucinezipper)由一段每7個氨基酸殘基就有一個Leu的伸展肽鏈組成，這些周期性出現的Leu都位于α-螺旋的同一側面，形成一個疏水的表面，因此兩條均含Leu拉鏈基序的蛋白質通過亮氨酸側鏈的疏水作用形成二聚體。

LLLLLLLL++++++++

NH2NH2COOHCOOH肽鏈氨基端富含堿性氨基酸殘基區，可與DNA結合。42堿性結構域富含堿性氨基酸殘基在許多DNA結合蛋白質中發現通常與其他的二聚體結構域如亮氨酸拉鏈或HLH基序中的一個聯合在一起，結果被稱為堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）或堿性HLH（bHLH）蛋白。蛋白質二聚體使兩個堿性結構域相鄰進而可與DNA發生作用。43N-端堿性結構域形成一個對稱結構，象一個夾子夾在DNA上44

++

++

++螺旋-環-螺旋(Helix-loop-Helix)

HLH由2個α螺旋間隔一個非螺旋的環(loop)組成，通過C端α螺旋的疏水作用形成二聚體堿性結構域堿性HLH蛋白與堿性亮氨酸拉鏈這種異二聚體的形成增加了轉錄因子的多樣性和復雜性NH2NH2COOHCOOH45轉錄激活結構域

是反式作用因子的轉錄調控結構域，一般由DNA結合結構域外的30-100個氨基酸組成1．酸性結構域也叫做“酸斑（acidblobs）”或“帶負電的長鏈（negativenoodles）”富含酸性氨基酸存在于許多轉錄因子的激活結構域中，如：yeastGcn4andGal4,

哺乳動物的糖皮質激素受體的兩個激活結構域462．富含谷氨酰胺激活結構域：

富含谷氨酰胺

（SP1，OCT－1，OCT

－2，SRF等）

3．富含脯氨酸激活結構域

富含脯氨酸有一個能激活轉錄的連續脯氨酸殘基鏈

（AP－2、Jun、SRF

等）474、轉錄因子的活化途徑：（1）需要時蛋白被合成，但很快被降解，不能積累。（2）通過與配體結合被活化。（3）通過磷酸化被活化。（4）結合DNA亞基的加入，與帶有轉錄激活結構域的蛋白質形成復合物。（5）通過抑制因子的磷酸化，暴露隱蔽的活化區域。（6）通過去除一個抑制蛋白，刺激轉錄因子入核。48真核轉錄后調控可變剪切反式剪切49mRNA前體的可變剪接mRNA前體通過不同方式的剪接，可由一個基因的轉錄產物產生出不同的成熟mRNA，從而翻譯出不同的蛋白質的過程稱為可變剪接（alternativesplicing）或選擇性剪接。來自一個基因的mRNA前體因可變剪接產生多種成熟mRNA，翻譯出不同的蛋白質，或形成一組相似的蛋白質家族，都可稱為同工型蛋白質（isoform）。5051順式剪接剪接過程一般發生同一個RNA分子的內部，即通過剪接將一個RNA分子內的內含子剪掉，使外顯子連接在一起，這種剪接方式稱為順式剪接（cis-splicing）。52兩種不同來源的RNA前體分子的內含子之間具有互補序列時，發生反式剪接（trans-splicing）。反式剪接53翻譯水平調控翻譯水平的調控是真核生物基因表達多級調控的重要環節之一。真核生物翻譯水平調控最普遍的機制是起始因子的磷酸化。mRNA結構與穩定性與翻譯控制掩蔽mRNA（maskmRNA）：蛋白質結合到mRNA上并阻止翻譯。54uORF調控翻譯過程uORF：上游開放讀碼框。酵母GCN4基因的mRNA的翻譯收到四個uORF的調控。55基因沉默基因沉默（genesilencing）：指生物體中特定基因由于種種原因不能表達或表達量很低的遺傳現象。轉錄水平的基因沉默(TGS)轉錄后水平的基因沉默(PTGS)DNAmRNAProteinDNAmRNAProtein56是由dsRNA介導的，通過目標mRNA的降解而使特定基因沉默的現象。

RNA沉默DNAmRNAProteinRNA