化學發光磁酶免疫分析法檢測梅毒螺旋體抗體答辯人：楊璐導師：崔亞麗教授李如琳副教授

西北大學Contents1.背景介紹3.全文總結2.實驗部分梅毒

●

梅毒螺旋體

●嚴重性傳播疾病

●發病率不斷上升

2010年4月國家衛生部全國法定傳染病疫情報告：全國乙類法定傳染病發病第３位梅毒檢測：●孕前檢查

●供血者血液常規篩選檢查西北大學醫院常用梅毒螺旋體免疫學檢測方法快速血漿反應素環狀卡片實驗試驗（RPR）和甲苯胺紅試驗(TRUST)初篩假陽性高判斷主觀梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA）和梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）

確認

判斷主觀操作繁瑣要求嚴格梅毒ELISA實驗靈敏度有待進一步提高

西北大學化學發光免疫分析技術免疫分析系統化學發光分析系統（抗原、抗體，免疫反應）★免疫分析高特異性及化學發光高靈敏度于一體（酶的化學發光底物或氧化劑）西北大學梅毒螺旋體抗體化學發光法檢測靈敏度極高自動化化學發光技術

●靈敏度極高

●較寬線性范圍

●精密度高

●容易實現自動化★廣泛應用于醫學、食品、分析化學等領域西北大學化學發光法檢測梅毒的商品化試劑盒國外：

Abbott：ARCHITECTSyphilisTP磁粒

國內：北京科美東雅生物技術有限公司：梅毒螺旋體抗體化學發光試劑盒酶標板

西北大學聚乙烯酶標板●板表面包被面積有限●反應空間有限●靈敏度受限化學發光固相載體的選擇磁性微粒●比表面積大●分散性好●易分離●靈敏度更高西北大學金磁微粒化學發光檢測方法GoldMag-AS微米金磁微粒1.生物分子固定化容量大

2.超順磁性，易分離

西北大學包被反應檢測實驗原理西北大學第一部分方法的優化1HRP標記抗原稀釋液的確定2包被抗原最佳用量及酶標抗原最佳工作濃度的確定3樣本稀釋液的確定4保護劑的選擇西北大學HRP標記抗原稀釋液的確定aPBST+20%小牛血清bPBST+0.1%BSAcPBST+0.5%BSAdPBST+1%BSAePBST+1.5%BSA降低非特異性吸附：

加入非特異性蛋白與表面活性劑陰性樣本的發光值西北大學包被抗原和酶標抗原最佳工作濃度的確定

抗原包

被量(ng/孔)酶標抗原稀釋度

701402102803501:2000PN660271652562954603945677336671:3000PN21742744571735502494644947601:4000PN13746543501538501816563171541:5000PN1404247850118142554342943341:6000PN12142319386574249434201927最佳抗原包被量：210ng/孔；最佳酶標抗原工作濃度：1：3000西北大學樣本稀釋液的確定陽性血清稀釋倍數檢測結果1×PBS生理鹽水PBS+0.1%BSA

正常人血清1:25++++1:50++++1:100++++1:200++++1:400++++1:800++++1:1600++++1:3200++++1:6400+-+-++1:12800--++1:25600--+-+-1:51200----最佳樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA檢測靈敏度與正常人血清相當西北大學保護劑的選擇保護劑X對HRP標記抗原的保護作用良好HRP標記抗原置于37℃、放置6天西北大學保護劑X對包被抗原金磁微粒的保護作用包被抗原金磁微粒置于37℃、放置6天穩定性很好西北大學保護劑Proclin300與保護劑X的對比實驗選定濃度為0.05%的Proclin300作為保護劑西北大學保護劑Proclin300對HRP標記抗原的保護作用含0.05%Proclin300的HRP標記抗原置于37℃、放置6天西北大學第一部分實驗小結

在初步建立的化學發光檢測梅毒螺旋體抗體方法的基礎上進一步優化，確定各最佳工作條件如下：1.HRP標記抗原稀釋液：PBST+1%BSA作為HRP標記抗原稀釋液；2.抗原包被量：210ng/孔(7μg/mg)；3.酶標抗原稀釋濃度：1:3000時，發光強度達到最佳；4.血清樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA；5.保護劑：濃度為0.05%Proclin300的PBS緩沖液。西北大學4參考值6對比實驗1穩定性3標準曲線25精密度特異性第二部分實驗方法的評價西北大學穩定性化學發光試劑分別置于4℃冰箱和37℃生化培養箱中放置6天將陽性血清分別稀釋50倍、100倍、200倍、400倍后進行檢測西北大學精密度國家標準（≤15%）批內差：

2.86%～5%次數檢測結果陽性檢測平均值RSD（%）1PN542315573523624915605715574715594923586052PN59982359232363941561251558762359721560483.103PN60741562491563022365151561561560221562192.864PN62871561662367432365341559832360122362884.775PN59232357991564011561372361171560932360783.38西北大學批間差：

5.1%～9.7%西北大學次數

檢測結果

批次1批次2批次3陽性檢測平均值RSD（%）1PN389515391884829154822154487846921544419.72PN432915405284723154810154541154752845346.53PN3987841891544288478384431154246843446.24PN3995840968462415474284267843681543496.75PN401615397984572154226841461541441541815.1質控標準品10次重復測定結果質控品：抗-TP標準物質（2NCU/mL）相對標準偏差：5.42%西北大學標準曲線將梅毒螺旋體抗體質控標準品（4NCU/mL）梯度稀釋，在0.25～4NCU/mL范圍內線性良好Y=599.1X-165.9R2=0.9980西北大學參考值（臨界值確定）檢測100例臨床陰性血清樣本臨界值：⑴P/N≥2.8，計算得出該方法的臨界值為：COV=72.8⑵P≥X+3SD，計算可得臨界值為：COV=47.6⑶P/N≥2.1，計算可得臨界值為：COV=54.6發光值=54.6西北大學特異性陰性符合率均為100%·80例臨床血清樣本·20例乙肝陽性血清樣本（TP陰性）·20例丙肝陽性血清樣本（TP陰性）本次實驗：COV=N×2.1=54.6發光值西北大學乙肝陽性樣本檢測結果丙肝陽性樣本檢測結果COV=54.6COV=54.6發光值發光值乙肝血清樣本丙肝血清樣本陰性符合率均為100%西北大學化學發光磁酶免疫分析法與商品化化學發光試劑盒對比靈敏度比商品化化學發光試劑盒提高4倍陽性血清稀釋倍數檢測結果商品化試劑盒化學發光磁酶免法(MECLIA)1:100++1:200++1:400++1:800++1:1600++1:3200++1:6400-+1:12800-+1:25600-+-1:51200--西北大學

化學發光磁酶免法（COV=N×2.1=53.2）商品化化學發光試劑盒COV=N×2.1=26151）特異性對比實驗：二者相當，陰性符合率均100%發光值發光值20例陰性血清樣本20陰性血清樣本COV=53.2COV=26151西北大學西北大學第二部分實驗小結國家法規：《體外診斷試劑注冊管理辦法》·分析性能評估資料：分析靈敏度、分析特異性、檢測范圍批內不精密度、批間不精密度等項目·參考值（參考范圍）確定·穩定性研究資料《發光免疫分析試劑生產及質量控制技術指導原則》根據各個試劑盒的企業標準或者制檢規程進行檢驗，檢驗指標一般包括準確性、靈敏度、特異性、精密性（批內差）、相關性等，均應達到相應的質量標準。穩定性：4℃，及37℃加速破壞性實驗，均顯示保存穩定性良好；精密度：批內差在2.86～5%，批間差在5.1～9.7%，對質控品重復10次檢測，變異系數為5.42%，均達到國家標準（≤15%）方法評價結果西北大學標準曲線：在0.25～4NCU/mL范圍內線性范圍良好臨界值：臨界值為陰性對照血清均值的2.1倍特異性：檢測臨床TP抗體陰性血清，陰性符合率為100%，特異性良好對比實驗：靈敏度較商品化化學發光試劑盒提高4倍，特異性二者相當西北大學●穩定性●精密度●線性范圍●參考值●特異性●對比實驗●HRP標記抗原稀釋液●抗原包被量●酶標抗原稀釋濃度●血清樣本稀釋液●保護劑對方法進行比較全面的評價方法的進一步優化初步建立的化學發光磁酶免疫分析法全文總結：西北大學試劑盒研制成功中試放大梅毒抗體臨床科研血清盤梅毒螺旋體抗體診斷試劑國家參考品臨床試驗西北大學主要生產工藝及反應體系研究資料

半成品試劑盒的檢定成品試劑盒的檢定

Company

Logo

包被抗原酶標抗原試劑盒陽性對照品、陰性對照品研制Company

Logo主要原材料研究資料穩定性研究資料

批間穩定性標準品穩定性檢測試劑