發(fā)布發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局2023-01-082022-12-08ICS67.120.01CCSICS67.120.01CCSB45內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB15/T2833—2022PCRReal-timePCRmethodfordetectionofcanislupus-derivedmaterialsDB15/T2833—2022DB15/T2833—2022II前 言本文按GB/T1.1—2020《準(zhǔn)工導(dǎo)則 第部分標(biāo)化件結(jié)和起規(guī)》起草。本文件由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國二連海關(guān)。本文件主要起草人：王伊琴、陳少博、包勇敢、楊帆、荊文魁、蘇日娜、張志峰、常鴻、寇福軍、趙治國。DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022115 下列縮略語適用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)PCR（polymerasechainreaction）TAMRA:(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]4 縮略語Ct值 cyclethreshold每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。實時光 PCRreal-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴(kuò)增過程。下列術(shù)語和定義適用于本文件。狼源性成分檢測實時熒光PCR法范圍本文件規(guī)定了動物源性產(chǎn)品中狼源性成分實時熒光PCR檢測方法。（0.15ng/L。（GB/T6682 GB/T27403 22DNA提取DNADNADNAA260/A280在1.7～1.9PCR實時熒光PCR檢測7.2.1 反應(yīng)體系體積為25.0L，見表1。實時熒光PCR儀（加熱速率10℃/s以上）。高速臺式離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速12000rpm）。（3000rpm）天平（感量0.01g）。單孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。7 GB/T6682上游：5′-CCGTACTCTAGCTTACATA-3′；下游：5′-GAGACCTTCCAGATGAAA-3′；5′-(FAM)-TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA-(TAMRA)-3′。DNA。Tris-HCl(pH8.0NaCl。。K20mg/mL)75PCRDNA，B。DNA。ddH2O。6 表1 狼源成實光PCR檢測法反體系試劑名稱貯備液濃度mol/L反應(yīng)體系體積LPCR反應(yīng)預(yù)混合液—12.5上游引物（F）10.01.0下游引物（R）10.01.0探針（P）10.01.0模板—2.0ddH2O—補(bǔ)足至總體積為25.0檢測過程分別設(shè)陰性對照、陽性對照和空白提取對照。7.2.2 94℃，3min94℃，1060℃，1060℃時收質(zhì)量控制質(zhì)控對照應(yīng)滿足以下條件，否則應(yīng)重新實驗：Ct35.0；Ct35.0；Ct28.0。結(jié)果判定，2Ct28.0，2Ct28.01Ct28.0～35.0DNAPCRCtCt28.0結(jié)果表述檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。3444000rpm/min～5000r/min離心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～650LEP2CTAB1min。12000rpm離心10min350的1.2mol/LNaCl（2350L溶液。加入350L30min12000rpm10min。EP0.20min，12000rpm離心10min500L7512000rpm10min。，6015s～20s（。100LTEbuffer或DEPC附錄A（資料性）溶液配制及提取方法CTAB將5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用鹽酸調(diào)pH8.0后，定容至250mL，115℃高壓15min。CTAB稱0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高壓15min。1.2mol/LNaCl稱取28gNaCl，定容至400mL，115℃高壓15min。DNA0.5g～11.5mL～3.5mLCTAB12L～20L根據(jù)CTAB265℃至少1h(CTAB,1mL10。55附錄B（規(guī)范性）狼源性成分的目標(biāo)擴(kuò)增序列142bpCCGTACTCTAGCTTACATAACTCAG