第第頁單核細胞增生李斯特氏菌及檢驗單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的平安具有危急，該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威逼人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛生微生物檢驗中，必需加以重視。一、生物學特性

1、形態與染色

該菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小約為0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無芽胞，一般不形成莢膜，但在養分豐富的環境中可形成莢膜，在陳舊培育中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。

2、培育特性

該菌養分要求不高，在20--25℃培育有動力，穿刺培育25天可見倒立傘狀生長，肉湯培育物在顯微鏡下可見翻跟斗運動。該菌的生長范圍為2--42℃（也有報道在0℃能緩慢生長），最適培育溫度為35--37℃，在pH中性至弱堿性（pH9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，在pH3.84.4能緩慢生長，在6.5%NaCl肉湯中生長良好。在固體培育基上，菌落初始很小，透亮?????，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透亮?????。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培育后可產生窄小的β-溶血環。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)和改良McBride(MMA)瓊脂上，用450角入射光照耀菌落，通過解剖鏡垂直觀看，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。

3、生化反應

該菌觸酶陽性，氧化酶陰性，能發酵多種糖類，產酸不產氣，如發酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側金盞花醇、棉子糖、衛矛醇和纖維二糖，不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。

4、血清型

依據菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”13個血清型。致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。

5、反抗力

該菌對理化因素反抗力較強，在土壤、糞便、青儲飼料和干草內能長期存活，對堿和鹽反抗力強，60-70℃經5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min可殺死此菌。該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環素、磺胺均敏感。

二、流行病學

單增李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動物很簡單食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進行傳播。據報道，健康人糞便中單增李氏菌的攜帶率為0.6-16%,有70%的人可短期帶菌，4-8%的水產品、5-10%的奶及其產品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

該菌可通過眼及破損皮膚、粘膜進入體內而造成感染，孕婦感染后通過胎盤或產道感染胎兒或新生兒,棲居于陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是本病傳播的可能途徑，且有上升趨勢。

三、致病性

單增李氏菌進入人體后是否發病，與菌的毒力和宿主的年齡、免疫狀態有關，由于該菌是一種細胞內寄生菌，宿主對它的清除主要靠細胞免疫功能。因此，易感者為新生兒、孕婦及40歲以上的成人，此外，酗酒者、免疫系統損傷或缺陷者、接受免疫抑制劑和皮質激素治療的患者及器官移植者也易被該菌感染。該病的臨床表現，健康成人個體消失稍微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結膜炎、發熱、抽搐、昏迷、自然流產、腦膜炎、敗血癥直至死亡。

單增李氏菌的抗原結構與毒力無關，它的致病性與毒力機理如下：

1、寄生物介導的細胞內增生，使它附著及進入腸細胞與巨噬細胞；

2、抗活化的巨噬細胞，單增李氏菌有細菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細胞內的過氧物（為殺菌的毒性游離基團）分解；

3、溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培育物上清液中獲得，為SH活化的細胞溶素，有α和β兩種，為毒力因子。

四、檢驗和掌握

（一）檢驗

1、增菌培育

取回的樣品應在4℃下處理、存放和運輸，假如是冷凍樣品，則在檢驗前要保持冷凍狀態。

取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質杯中進行均質，然后轉入三角瓶中，30℃培育4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，連續培育20h和44h.。

2、分別

共培育24h和48h后，取EB培育物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3+LPM瓊脂平板上劃線。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置于35℃培育24-48h，LPM平板在30℃培育24-48h。然后，把LPM平板放于解剖鏡載物臺上，以450角入射光從平板下面照耀平板，通過目鏡垂直向下觀看查找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對比。

加入七葉苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系統，選擇可疑菌落的方法與在OXA上選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落四周有一個黑色環，其它菌也可形成黑色環，但形成時間要在兩天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相像。

在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5個或更多的典型菌落，分別劃線于TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個菌落。食品檢驗中在TSAYE平板上純化是必需的，由于在PALCAM和OXA或LPM平板上分別菌落時可能沾有不行見的受抑微生物。挑取5個典型菌落的緣由是一個樣品中可能分別到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培育24-48h，假如不用于動力觀看，也可在35℃培育。

3、鑒定步驟

（1）觀看TSAYE平板通過斜射光觀看，查找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對比。

（2）、從30℃或更低溫度下培育的TSAYE平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀看。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。假如菌量太少，菌體黏附于載玻片上而呈現非運動性。李斯特氏菌是細短桿菌，可見稍微的旋轉及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對比相比，球形、大的桿狀且快速泳動的都不是李斯特氏菌。

（3）挑取典型菌落進行過氧化氫酶試驗，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應。

（4）取16-24h的培育物進行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽性桿菌。但是陳舊培育物革蘭氏染色會發生變化，而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢，易誤認為白喉菌而錯判。

（5）挑取典型菌落接種于TSBYE肉湯管中，35℃培育24h用做糖類發酵和其它生化項目試驗。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天，也可反復接種。

（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時避開觸到平板底部和使瓊脂裂開，同時設陽性對比（單核細胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對比（英諾克李斯特氏菌），35℃培育48h。單核細胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環。

（7）在光明的光照下，觀看經穿刺的血瓊脂平板，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點產生較清楚的β-溶血環，英諾克李斯特氏菌不產生溶血現象，而綿羊李斯特氏菌產生界限明顯的較大溶血環，在此不要試圖進行種間的區分，但要記錄下溶血反應的特征，CAMP試驗可區分它們間的溶血反應。

（8）硝酸鹽還原試驗（選做）。用TSBYE肉湯培育物接種于硝酸鹽肉湯中，35℃培育5天后，加入0.2mL試劑A，再加入0.2mL試劑B，混合，消失紫紅色為陽性反應，表明硝酸鹽已被還原，如無顏色消失，在試管內再加入少量鋅粉，放置1h，如消失紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區分出默氏李斯特氏菌就必需進行這唯一的試驗。本試驗還有一等效試驗，即加入0.2mL試劑A后，再加入0.2mL試劑C，消失橙色表明硝酸鹽已被還原。如未消失顏色反應，也加入少量鋅粉，若消失橙色表明硝酸鹽未被還原。

（9）將TSBYE培育物穿刺到SIM和MTM試管中，室溫培育7天，每日觀看，李斯特氏菌呈典型傘狀生長。在MTM中傘狀生長更典型。同時，30℃的TSBYE培育物在油鏡下可見細菌作翻轉運動。

（10）將TSAYE肉湯培育物分別接種于0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發酵管內（可選用倒立發酵管），35℃培育7天，呈陽性反應的李斯特氏菌產酸不產氣，李斯特氏菌發酵鼠李糖和木糖的狀況見下表。全部李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發酵，除格氏李斯特氏菌均不能發酵甘露醇。假如在OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3+的LPM分別平板上菌落色素很明顯，則七葉苷試驗可免做。

李斯特氏菌屬的區分

種別

溶血

硝酸鹽

糖發酵

甘露醇

鼠李糖

木糖

單增李斯特氏菌

+

-

-

+

-

英諾克李斯特氏菌

-

-

-

V

-

威爾斯李斯特氏菌

-

-

-

V

+

西爾李斯特氏菌

+

-

-

-

+

格氏李斯特氏菌

-

-

+

V

-

綿羊李斯特氏菌

+

-

-

-

+

V:反應不定

4、血清學鑒定

下表顯示了李斯特氏菌種間的血清學關系。

李斯特氏菌的血清學關系

種別

血清型

單增李斯特氏菌

1/2A、1/2B、1/2C、3A、3B、3C、4A、4AB、4B、4C、4D、4E、“7”

綿羊李斯特氏菌

5

英諾克李斯特氏菌

4AB、6A、6B、Un（未確定）

威爾李斯特氏菌

6A、6B

西爾李斯特氏菌

1/2B、4C、4D、6B、Un（未確定）

將T