細(xì)胞工程綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和腎臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)TOC\o"1-5"\h\z班級(jí) XXXX姓名 XXXX學(xué)號(hào) XXXXXXXXXX指導(dǎo)教師 XXXX實(shí)驗(yàn)時(shí)間 XXXX成績 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和腎臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)姓名學(xué)號(hào)班級(jí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞原代培養(yǎng)培養(yǎng)的基本方法和操作過程。初步掌握培養(yǎng)過程中的無菌技術(shù)。了解在相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。二、實(shí)驗(yàn)原理原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動(dòng)物體內(nèi)獲取的細(xì)胞、組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動(dòng)物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分解成單個(gè)游離細(xì)胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長及繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必須的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。巨噬細(xì)胞屬天然免疫細(xì)胞，具有趨化運(yùn)動(dòng)、吞噬、分泌和參與免疫調(diào)節(jié)等功能，是科學(xué)工作者研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周多用做原代培養(yǎng)，不易長期生存。巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。目前，單核巨噬細(xì)胞株也有，比如RAW264.7，但價(jià)格比較貴，且保存也不方便。培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞，目前以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用，而目前獲取小鼠巨噬細(xì)胞的方法有兩種，一種是直接用培養(yǎng)液灌洗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔，從腹腔灌洗液中分離巨噬細(xì)胞，還有一種方法向動(dòng)物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，礦物油，PRMI1640培養(yǎng)液等），這樣使機(jī)體產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞后再腹腔灌洗，但由于許多刺激物能激活巨噬細(xì)胞，而被激活的巨噬細(xì)胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)用于培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞中的刺激物不能很快被消化而殘留在細(xì)胞中，影響細(xì)胞代謝，同時(shí)也不能很好的模擬體內(nèi)環(huán)境，所以我們直接用培養(yǎng)液灌洗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔，從腹腔灌洗液中分離巨噬細(xì)胞。腎臟細(xì)胞:所有組織中都有一定量的細(xì)胞間質(zhì)（纖維和基質(zhì)等），對(duì)細(xì)胞生長有妨礙作用，用胰酶消化能出去間質(zhì)，使組織松散成單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞易于生長。三、主要試劑小鼠1只、PRMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和EDTA、PBS緩沖液、青霉素、鏈霉素、75%酒精、蒸餾水四、儀器設(shè)備解剖盤、鑷子、剪子、手術(shù)刀、蓋玻片、吸管、顯微鏡、無菌操作臺(tái)、5ml注射器、注射針、試管、培養(yǎng)瓶等。二氧化碳培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、低溫冰箱五、實(shí)驗(yàn)步驟溶液的配置小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)1、 以頸椎脫臼法處死小鼠。2、 手提鼠尾將其全浸入75%乙醇中10s,倒立小鼠并向腹腔內(nèi)注射預(yù)冷至培養(yǎng)液5ml（注意針尖勿傷及內(nèi)臟），仰臥平放并輕揉小鼠腹部2?3min，靜置5?7min。3、 置小鼠于解剖臺(tái),用針頭固定四肢,在腹股溝區(qū)作一橫切口,撕裂皮膚以完全暴露出腹膜壁，但勿傷及腹膜壁。4、 用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)，并促使巨噬細(xì)胞從腹腔的漿膜表面釋放，形成細(xì)胞懸液。5、 用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。6、 小心拔出針頭，把腹腔液注入離心管中。7、 將細(xì)胞懸液于4°C、1000r/min離心5min,棄上清，取3ml的加雙抗的培養(yǎng)基進(jìn)行吹打，放入培養(yǎng)瓶中，再在培養(yǎng)瓶中加入2ml的培養(yǎng)基。8、 將擰緊口的細(xì)胞培養(yǎng)瓶放進(jìn)CO培養(yǎng)箱中，然后，將瓶口松1.5圈（保證細(xì)胞呼吸），2平放著混勻細(xì)胞，過夜培養(yǎng)。9、 第二天進(jìn)行細(xì)胞換液；第三天觀察細(xì)胞生長情況并拍照。腎臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)1、用品消毒后，安放在超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外線消毒，做好洗手等準(zhǔn)備工作。2、點(diǎn)燃酒精燈，用品按布局放置，安裝吸管等3、取材取新生乳鼠一只，采用頸椎脫臼法處死，然后把這個(gè)小鼠入盛有75%酒精的燒杯中10秒，隨即攜入超凈工作臺(tái)內(nèi)。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出小鼠，置于消毒培養(yǎng)皿中打開消毒器械包用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚，用解剖剪剪開腹腔，充分暴露腹腔，用另一鑷子輕輕夾起腸管，翻置一側(cè)，充分暴露位于腹腔背壁脊柱兩側(cè)的腎臟取下雙側(cè)腎臟，放入消毒培養(yǎng)皿中（去除腎盂、腎門和腎外表皮）用吸管吸取PBS加入培養(yǎng)皿中，清洗腎臟3次，盡量去掉血污再將腎組織用解剖剪剪成幾塊再用PBS漂洗，去凈血液為止。4、消化將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶內(nèi)反復(fù)剪切組織直至lmm3大小的組織塊加入5-8倍量（體積）的0.25%胰蛋白酶，蓋好放入37C細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化30分鐘，注意應(yīng)每隔10分鐘振搖一次。當(dāng)組織塊變得疏松，顏色略白時(shí)，取出置于超凈工作臺(tái)內(nèi)靜置后用吸管吸去上清，加入一定量的培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打組織塊，使大部分組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，讓未消化完的組織塊自然下沉，將上部的組織懸液移入消毒離心管中離心。5、離心離心管平衡后，以1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，超凈工作臺(tái)內(nèi)開蓋，吸取上清液加入5ml培養(yǎng)液，蓋蓋，注意應(yīng)有空隙，標(biāo)明細(xì)胞名稱，代數(shù)，日期，將培養(yǎng)瓶置于37C細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。6、第二天進(jìn)行細(xì)胞換液；第三天觀察細(xì)胞生長情況并拍照。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠巨噬細(xì)胞（六）小鼠腎臟細(xì)胞（六）七、分析和討論由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，我組的實(shí)驗(yàn)很成功（基本上掌握了本次實(shí)驗(yàn)涉及的所有技術(shù)）。培養(yǎng)生長出來了較多較大的巨噬細(xì)胞，可以清晰地看到一粒粒的梭形巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)在眼前，非常的清楚明了，甚至可以作為標(biāo)本。說明此次巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)特別成功當(dāng)然也得到了一定量的腎臟細(xì)胞，只是相對(duì)來說比較明顯的腎臟細(xì)胞的量較少，且只看到了一個(gè)。分析原因：液體培養(yǎng)基在分裝過夜處理時(shí)可能是染菌了，不能用來進(jìn)行小鼠細(xì)胞的培養(yǎng)，只能借助于其他組的，其次在操作過程中也損失了部分腎臟細(xì)胞。八、心得體會(huì)1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)要求要無菌操作盡量避免感染雜菌。2、本次實(shí)驗(yàn)的過程設(shè)計(jì)由我們各組自己查閱文獻(xiàn)制定具體方案，所以，我們?cè)诓僮鬟^程中更能知道實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)步驟的原理和目的，收獲更大。3、為了防止器皿表面的雜菌污染里面的細(xì)胞或培養(yǎng)液，在開蓋前，先用75%的酒精擦拭瓶蓋