1、精品文檔第三十五章DNA的重組第一節同源重組、Holliday模型二、細菌的基因轉移與重組致育因子（F因子）通過結合作用由F+細胞向F-細胞轉移，F質粒約1/3的基因與轉移有關，traS和traT基因編碼表面排斥蛋白，阻止F+細胞之間的轉移，F+細胞的性菌毛與F-細胞結合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構成轉移的通道，在TraI在TraY的幫助下結合到轉移起點oriT上，切開一條鏈，使其5'端進入受體細胞，并合成其互補鏈，使F-細胞轉化為F+細胞，給體細胞中的單鏈也可以合成互補鏈。在細菌基因轉移的不同時間將配對細胞分開，可以確定基因在染色體上的位置。F質粒DNA可以通過重組整合到受體的

2、染色體中，使受體菌成為高頻重組（Hf）菌株，若F質粒的DNA未能完整地進入受體菌，則受體菌不能轉化為F+,F質粒的DNA可以被切割出來，有時可攜帶宿主菌的染色體DNA,稱作F'因子，F'因子攜帶的基因可在受體菌表達。外源基因可以進入感受態細菌，稱作轉化，自然條件下感受態的形成需要10多種蛋白質參與，實驗室常用高濃度的Ca2+處理使細菌形成感受態。通過噬菌體將細菌基因從供體菌轉移到受體菌稱作轉導，若宿主菌任意部位的基因取代噬菌體DNA的一部分轉入受體菌，稱作普遍性轉導，若宿主整合部位的DNA取代了噬菌體的部分DNA稱作限制性轉導。進入受體菌的基因可與染色體重組。用溶菌酶除去細菌的

3、細胞壁，人工促使原生質體融合，可引起廣泛的重組。大腸桿菌染色體的基因圖噬菌體的基因重組三、重組有關的酶依賴RecBCD起始的重組模型：RecBCD有依賴ATP的核酸外切酶、核酸內切酶和解螺旋酶活性，當DNA斷裂時，它結合在其游離端，使其解旋并降解，直至酶移動到chi位點(GCTGGTGG)，在其3/側4-6核甘酸處將鏈切斷，產生3/游離單鏈，隨后單鏈與RecA結合，開始同源區重組。精品文檔護apgrlvi.卜|TX4bfcMAlaiI1hriWHbRecA蛋白的絲狀聚合體與DNA的相互作用II'，l巾啜UUtWR叫Wbllr'.H.nutri：kc|2rRecA蛋白的帶狀圖解R

4、ecA蛋白的絲狀聚合體，每一圈螺旋由6個RecA蛋白單體構成，其中一個單體由紅色標出。RecA蛋白引起DNA同源重組的模型 luTIK 山要Ml'DNA duplex在大腸桿菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白參與的同源重組。(a) RuvA四聚體的圖解。四個亞基形成的結構像四個花瓣的花。(b) RuvA/RuvB的作用：(左)RuvA四聚體結合到Holliday位點；(中)RuvB六聚體結合到雜合雙螺旋的兩對面，DNA穿過其中心，RuvB六聚體的作用像馬達，促進超螺旋分叉點通過復合體移動。(右)RuvC結合到Holliday位點，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點由剪切體辨認。(c

5、) RuvA四聚體的電荷分布，藍色表示正電荷，紅色表示負電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有四個負電荷區域位于其中心。(d)假設的RuvA四聚體與Holliday位點結合的結構模型。第二節特異位點重組(alLnicoinhiniiiliun修iliithe3nl召ontrniaiionjIbl*4MTittirXi加量hiMtnwiNTIMFns+xrsFlQUMM-4#1/4事miln«2*NIwi"wWw鏟*tw*kllwnmnuml*ddA*h*H*IE%ApK卞OH>-jnF>4w，rcmhI*hp,/aj«ff4rtr*精6dWtyMwlwh

6、"iiinRiItidh*“華41nltf1*rt4*w»>i4llwtvuftkifl臚f>FW<tw*rm*jefeKiwfc'rt»u»皿艮4AdjHqt«4ih|id*n*rgr*dDna.riwmIt，AMvgpiiifer中HlGmJ2Gufe-JJJfil'LnnilAlL-i-mlilwyEjm.*/w*1卜KvOiwdlt,#irl*Jrflu14hvKvdIti,rfwlfc«flhilferIhMhH-HJfn用據，*ME*BfdlinI卜q/，4nM53«>3e

7、fKi*ib-Hwfwtwifum細菌的特異位點重組沙門氏菌兩種鞭毛蛋白表達的調控DHA>| H,rnwiMr fi-iF 叩白 /nd npprr尸of 附僦1 -IMnobr/酎呼:,' hiRNAd " nnd T mKNAI IIhn monlWnmF'UBflAg*Uin吵pro4#iA i*pr»sMiriTrunx>owdwffiwnl11 ： TfliR而ri|AJX'.ifi tiHNA:M nilWAHtn recubiHueRiC riiUinFIGURE llU3l RtfpJ.Miefli O< llffl

8、ll R4W4 面 JvpeMi pkfeH *IMF DwitixiiHti erf fr" tnd 曲/ rW dfire，Tb* hm #rr + - mberwifle thatrjtlHm IGrFk* “ 癡 1*14 出用3hl onUrta.fw |iif p-P4W.4ef ind h hjn .可源 Tb*Hlo i mrwj<wd rrllbdl Si « /Jk” 5 “1 T”FflOt，ih 局口 h4lr<ig wdh i»fWMior priiiMn，髀vdKi 詞修學 M； » i 4*e m，J- g>

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10、;w*rfe«<Ti GnHJMKTH免疫球蛋白基因的重組IgG的分子結構»muiCH/h”HckhtitbiiMtr11iiiijekiotiFhR雕？匕44tnMihvV.rH|*ioe(4ItirhtriTunl*CL>ppjbhrdihuijii.ihiKpEudm9Mli*伊jrat*小dnNn$1ihp*«ph%m-hViminwnt#11bo-30DiJCfp£is«nlMH*HWRHvxnlc卜一(krin-lirONAHJi棺點IK-IT峭小中u<|£M*inJl><>MMKmrm

11、micvMRm4nbmdontMmdwDMAgwi鼻mjpjinkiuUr%wdj1,£即加珈W*rmBrntlEHnrultsnwm13、鼻HbfM，VmdJymuuiwMrit*iLfi口imhoniMyniBcin二|七*1inihjpi眄inmJjtfcMi：durr%F»cKj|inpjh|»prkhsTh*lightdtiilBcanrQinbAM*"hjmt；»pzkLdiiin*+，.事njrvbdytnolruiMatun*】*9H*chainUj4I.,BnktQtotr9n*cnp<)m：Hv1固IPFIcivinv

12、.dnT?iqnonrfftbclViwn耳andCHrmRNAsplicingPrim”TYtrnKiriiln1Lhl-ch«biIU-.Jpel>iKiAbdvVMilbitOf&KtJifitrvftonrpfebwipnX*lntuldlni，血取7皿附VfijJj|CmHNA重組位點有7和9nt的信號序歹U,中間間隔12或23bp。免疫球蛋白基因重組的模型重組酶(RAC1/RAC2)復合體與重組信號序列結合。復合體使編碼序列與重組信號序列之間的雙連斷裂，編碼序列的末端形成發夾結構。重組信號序列結合形成環狀結構。編碼序列連接前經過加工，連接位點不十分確定，增加

13、了免疫球蛋白的多樣性。DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA連接酶參與了加工和連接過程。在不同的核甘酸位點重組可以生成不同的蛋白質。第三節轉座重組I"""VAcct舄核.TGCl-TOiCJmBCAPtBET83丁【;11人林01入CUTAEtHF喇r4r卜iu*hl一=一.一"HG".TMWWPIWfgMITiKKTg<；aTC<=AlCCST，愚工!&1Ai-GTIdlTF11I<il，tillFihl；.17|打I.MLi；1L.cH(ifAlhiAni-1i(i>ii-1.dk一、細困的轉座因子1S

14、.2Insert沁nsequencesaresimpletmnspositionmodtiles插入因子轉座子具有反向末端重復序列以及在靶部位兩側產生的同向重復序列。在該例中靶序列為5bp,轉座子末端由9bp反向重復序列組成，數字1-9指序列重復堿基對。Figure15ITransposonshavemveiledteimittalrcpeiitsmidLu'iiciiUcduectrepealsoffhiikii里DNA阻thehirgeisiteInthisexample,tlioteugetisa5bpsequenceTheendsofthetrailsposoiiconsist

15、ofinvertedrepeatsof9bp,wherethenumbeta1Ii，nigh1-indjcutchsequenceofbasepairsPLrtk£irL-3口noFix>92i999RRJ1 5.3 Com positetraiispuson hdve IS組合型轉座子：兩個插入序列之間夾著一段序列（可以是某個基因，如抗性基因）。兩個插入序列可以同向或反向排列，有時均有轉座活性，有時只有一個有轉座活性。figure152AcoinpositetistnsposonhngaCLiitulII”口JLHikcisISlitj:lxdiresistaiice)Han

16、kedbyISnioduleaThemoduleshave；-hcninviiicdicmtinalrepcIfthemodulesIhemjclvesaicininvertedorientationrasdrawn),Hie!?hortinvertedterniinarepealsatihccn<1aftlie：Mi!<pOf；LHiMieideillical復合型轉座子：插入序列被轉座酶基因取代，圖示為Tn3（TnA家族）的結構。兩端為38bp的反向重復，其兩側為5bp的靶序列，tnpA編碼轉座酶，tnpR編碼的蛋白質可以作為解離酶（使轉座子與受體DNA形成的共整合體重組和解離

17、），也可以作為阻遏蛋白調節tnpA和tnpR兩個基因的表達，res為解離的控制位點，TnpR蛋白結合于其上發揮調控作用。轉座的方式轉座子可用不同的方式轉座，轉座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色體的斷裂、重復、缺失、倒位、易位等變化。15.3CompositetransposonshaveISmodulesFigure153TwoIS10ImodulescreateaIcompositetransposonthatIcaninobihzeanyregionIofDNAthatliesbetweenIthemWhenI'ntOispartIofasmallcncularIinole

18、cuIe.theIS10Irepeatscantfatisposc|eithersidecfthecircle兩個IS10組件構成一個復合轉座子，它能使位于他們之間的任何DNA易位。當Tn10是個小的圓形分子的一部分時，IS10重復序列可轉座至環狀分子的任一側。插入序列使靶序列的數量增加，在插入序列兩側各有一個。Staggeredmade i: target srteTransposon jonea tc sn git-branded ericsFigure 15.4 The direct repeats of target DNA ITaiiking a transposon are gen

19、erated by the introduction of staggered cuts whose protruding ends are linked to the transposon.15 4 I ransposiiion occurs by l卬th ruplicativc and nonreplicadvc mechanisms復制轉座作用產生了轉座子的一個拷貝，它插入到一個接受位點。給予位點保持不變，以致給予者和接受者都有轉座子的一個拷貝。G書和吠targetsitefliecinandsealedFigure 15.5 Replicative transposition cre

20、ates a copy ot the IransposoiK iduch insetts at a recipient site. Hie dewr site renriins unchanged so both demor and recipient have a copy of the Iransposn口.非復制轉座作用在未被修復的情況下，可能造成致死突變。154Iranspositia】occursbvbothreplicalhe:iridnonreplicativeniediantsiiis15.4Transpositionoccursbybothreplicativeandnoii

21、feplicativemechmusiiisFigureI5.6oiireplicalieInntsposi口onallowsab'iwisposoiitomoveasaphysicalentityfromadonortoarecipientsitellusleavesabreakatthedonor3依whichislethalunlessiicanberepaired保守的轉座作用不造成核甘酸的丟失，如入噬菌體的整合和切除。DonorRecipient15,4 Transposilion qqcuts by both replicative and nonrqilicatne me

22、clianistnsFigure157Consenativetranspositionuivohesdirectmovementwithnolossofnuckolidcbonds:comparewitlilambdamUirratioitandexcisionJnorRecipient反向重復序列的重組能引起其間序列反向排列。Figure 15.8 Reciprocal recombination bctuccn direct repeats excises the material between tlicni. each product of recombination has one

23、copy of the direct repeal.Xanng of direct /eoeatse;omDinaticn rgieases material tstwesn 叫 oeats as circulaTHTolecule轉座子引起DNA的重排，正向重復序列的重組引起其間序列的切除或插入。155TransposonscatiserearrangeinentofDNAInverted repeatsinvented repeats pairFigure 15.9 Reciprocal recombination between in x cried repeats inverts th

24、e region between them.15.5TransposonscauserearrangementofDNA轉座作用可引起給體和受體的整合或分割，并可引起轉座子拷貝數的增加。Figure15.12Transpositionmayfuseadonorandrecipientrepliconintoacointcgratc.Resolutionreleasestxvoreplicons,eachcontainingacopnfthetransposon,15.7Replicativetranspositionproceedsthroughacointegrate二、真核生物的轉座因子原

25、核生物的轉座酶主要作用于產生它的轉座因子，表現出順式顯性。真核生物的轉座酶可以作用于任何末端具有該酶所識別的反向重復順序的DNA,使其轉移到相應的靶位點。在玉米白勺激活-解離系統(activator-dissociationsystem,Ac-Ds)中，Ac編碼轉座酶(自主因子），Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中間序列形成白1無轉座酶活性，但隨Ac轉座后可抑制鄰近基因的表達。在玉米白抑制-促進-增變系統（suppressor-promotor-mutator,Smp）中，Smp和En（增強子）序列相似，均為自主因子，與其對應的非自主因子dSmp為有缺陷的Smp因子，轉座后，若Smp插入

26、靶基因附近的合適部位，可以促進靶位點基因的表達，若Smp插入外顯子，可抑制基因的表達。百田MDtE5.11(oiHrollinekmviihinmemu8cj<ndrearranmvntsUSWMiHf1riJlTMM0t*Figure 15,23 Ds provides a site to inilialc the thioimUid fii siun- bndgc-brctikigc cycle he products crui be fallowed hy clonal analysis.wrbrir tr圳，rt 3 e a « o口TUTObF El二皿1陋廠且, U

27、jiMMrE：5f 同 rtf i-hnira玉米的控制元件形成轉座子的不同家族，每個家族均有自主和非自主成員。廿B! IE! W G15.12Controllingelementsinmaizeformfamiliesoftransi)osonsFigure 15.24 Each controlling element family has both auhiotnmis and nonautonomoiis tn cm bet s. : tu toiiom uu s clc ni ent & arc capable of transposition Nonautonomoiis e

28、lements are deficient in transpositiim, Pairs ot autonomous and nonaulonomous elements uati be c Lis st Red in 4 families4Auronomous7W/V女mt加4VH rr 匚兀 jtjpPecur?s3Tonxncnr削mPkipm suppttssoGmuiator爐號總匚理 Spm)rn (emanceri7 (irtlffiror)DatedJfirsr ec寸'八rm城P品系的果蠅含有40-50個P因子（一種轉座子），P因子的mRNA前體含有3個內含子,若P

29、品系雄性與M品系雌性交配，子一代的體細胞mRNA前體加工時保留了第3個內含子，合成阻遏蛋白，不發生轉座，性細胞mRNA前體加工時切除了全部3個內含子，活躍的轉座使性細胞失去功能。P雄性或M雄性與P雌性交配時，由于雌性的卵細胞質中存在抑制P因子轉座酶活性的蛋白質，子代的生殖功能正常。第四節真核生物基因表達的轉錄前調控410%的DNA在發育過程中1 .染色體丟失：如四膜蟲的大核為營養核，由小核發育而來,被丟失。2 .基因擴增：如非洲爪蟾卵母細胞的rDNA可以大量擴增，形成1000個以上的核仁。3 .基因重排：重排可以使表達的基因發生切換，也可以產生新的基因。4 .組蛋白的乙酰化和去乙酰化：組蛋白的

30、乙酰化和基因表達的狀態相關。組蛋白H4的乙酰化不足(underacetylation)是雌性哺乳動物一條X染色體失活的原因之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有關。5 .染色體DNA的修飾和異染色質化：DNA的甲基化可以使其失去轉錄活性，高度甲基化的DNA可以形成高度壓縮的異染色質，異染色質的基因無轉錄活性。6 .染色質結構改變模型-組蛋白置換占先模型(pre-emptivemodel):決定的因素是轉錄因子和組蛋白誰先占據調控位點。DNA復制時，組蛋白8聚體解離，轉錄因子乘機結合到調控位點上，一直持續到下一個復制周期，抑制了組蛋白和DNA的結合。例1:當5srRNA基因與組蛋白結合時TFmA不能激

31、活此基因。而TFmA可與游離的5srRNA基因結合，再加入組蛋白不能使此基因失活。例2:含腺病毒啟動子的質粒能被TFIID結合，再被RNApoln轉錄，如先加入組蛋白，則不起始轉錄，如先加入TFnD則形成的染色質中，模板仍能轉錄。動態模型(dynamicmodel):組蛋白置換需輸入能量。一些轉錄因子結合DNA時可裂解核小體，或建立一個可產生核小體定位結合位點的邊界。如果蠅Hsp70啟動子上的核小體在體外實行重建。GAGA(細胞核結合蛋白)轉錄因子與啟動子中4個富含(CT)n位點結合，破壞了核小體，形成一高敏感區，而且導致鄰接的核小體重排，這樣它們就優先插入到隨機位點。核小體打開的過程是需要水解ATP的耗能過程。7 .細胞周期的調控最關鍵的是兩個蛋白質家族：周期素(cyclin)家族和依賴周期素的蛋白激酶(cyclin-dependingproteinkinase,CDK)家族，目前發現的周期素有10種以上，用字母A,B,C等表示，CDK有8種以上，用CDK1,CDK2,CDK3等表示。周期素A,周期素D,CDK2,CDK4的合成受轉錄因子E2F的調節，他們共同的作用控制著G1期向S期的轉化，周期素A