1、響應(yīng)面分析法優(yōu)選生精湯中淫羊藿苷的提取工藝研究        【摘要】  目的優(yōu)選生精湯中淫羊藿苷提取的工藝條件。方法采用響應(yīng)面分析法，以提取物淫羊藿苷含量為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間等因素對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果優(yōu)選出醇提淫羊藿苷的最佳工藝為：加30倍量70乙醇，回流提取1.75 h，提取兩次。生精湯中淫羊藿苷的含量為1.36 g/g。結(jié)論該方法簡便易行，穩(wěn)定性好，適于化生產(chǎn)中應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】  響應(yīng)面分析法； 淫羊藿苷； 提取工藝； Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)生精

2、湯由菟絲子、淫羊藿、熟地、補(bǔ)骨脂、女貞子等11味中藥組成。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1證明生精湯能顯著降低模型大鼠血清雄激素含量，增加血清雌、孕激素含量促排卵。經(jīng)多年臨床應(yīng)用2證實(shí)的生精湯為中醫(yī)藥補(bǔ)腎活血法女性多囊卵巢綜合征的有效組方。淫羊藿為處方中的君藥，淫羊藿苷類黃酮化合物為其主要有效成分，此外含有生物堿、木脂素、多糖和微量元素等。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明3，4，淫羊藿總黃酮具有性激素樣作用，可以使雌性小鼠子宮增重、E2含量升高、雄性小鼠血清T含量升高。淫羊藿苷能延緩卵巢卵母細(xì)胞巢破裂，抑制原始卵泡的發(fā)育啟動(dòng)，減少卵泡的消耗，使處于靜止期的原始卵泡數(shù)增多5。淫羊藿總黃酮為生精湯治療女性多囊卵巢綜合征的主要有效成分

3、之一。響應(yīng)面分析法6以回歸方法作為函數(shù)估算的工具，將多因子試驗(yàn)中因子與試驗(yàn)結(jié)果的相互關(guān)系函數(shù)化，可研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并可進(jìn)行優(yōu)化。本文采用響應(yīng)面分析法，以提取物淫羊藿苷含量為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察藥材的料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間等因素對(duì)提取工藝的影響，優(yōu)選淫羊藿苷的最佳提取工藝，以便提出更多的有效成分，提高治療效果。1  儀器與試藥1.1  儀器LC-10AD高效液相色譜儀（日本島津公司），CLASS-VP色譜工作站，GL-CQ-250S超聲波清洗機(jī)（上海杰理科技有限公司），AE-240天平(上海梅特勒一托利多儀器有限公司)。W一201B數(shù)顯恒溫水

4、浴鍋(上海申騰生物技術(shù)有限公司)，R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海申勝生物技術(shù)有限公司)。1.2 材料與試劑生精湯中各藥材（菟絲子、淫羊藿、熟地、補(bǔ)骨脂、女貞子、山藥、雞血藤、劉寄奴、王不留行、制香附、生麥芽）購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)姚振生教授鑒定。     淫羊藿苷對(duì)照品購自藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110737-200312，乙腈、甲醇(供高效液相色譜測定用)為色譜純，超純水，其余為分析純。2   方法與結(jié)果2.1  淫羊藿苷的含量測定72.1.1  色譜條件色譜柱為phenomenex-Genmini-

5、C18(4.6 mm×150 mm)；流動(dòng)相為甲醇水（5248）；流速1.0 ml·min-1；檢測波長270 nm；柱溫30；檢測靈敏度0.02AUFS；進(jìn)樣量20 l。2.1.2  對(duì)照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品2 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含有0.24 mg淫羊藿苷的溶液，作為對(duì)照品溶液。2.1.3  供試品溶液的制備按處方取生精湯各味藥材，精密稱定，回流提取兩次，合并提取液，混勻，濃縮至100 ml，取1 ml用0.45 m微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。2.1.4  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸

6、取對(duì)照品溶液，倍半稀釋后，分別注入液相色譜儀，記錄淫羊藿苷峰的峰面積。以進(jìn)樣濃度C(g/g)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=2×106C+109 929，r=0.999 9。表明淫羊藿苷在4.80.15 g范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取濃度為0.2 g/l的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 l，測定峰面積，RSD=0.28%，表明儀器精密度良好。2.1.6   加樣回收實(shí)驗(yàn)取已知含量的生精膠囊樣品0.25 g，共5份，分別加入0.2 g/l的淫羊藿苷對(duì)照品10 l，其余同“2.1.3”供試品溶液的制備方法制備，按“2

7、.1.1”色譜條件進(jìn)樣20 l，測定峰面積，并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為100.4%，RSD=2.5%，表明本方法具有較好的加樣回收率。1         2.2  淫羊藿苷提取工藝研究2.2.1  響應(yīng)面分析法因素的選取及方案分析按照處方分別稱取生精湯各藥材，共20.4 g，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理6，綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度3個(gè)因素，每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以-1，0，1編碼，以淫羊藿苷得率作為響應(yīng)值（Y）。采用SAS9.1.3對(duì)實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。試驗(yàn)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。表2  實(shí)驗(yàn)因素與水平（略）表2  響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果（略）2.2.2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用SAS9.1.3軟件對(duì)表2中不同試驗(yàn)條件下所得到的淫羊藿苷得率進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得擬合方程：Y1=0.808 7 + 0.291 65 X1 + 0.044 25 X2+ 0.059 575 X3+ 0.021 2 X12- 0.172 6 X1X2 + 0.0377 X1X3- 0.093 6 X22 - 0.003 25 X2X3- 0.348 2 X32。表3  回歸方程顯著性及方差分析（略）

9、由表3可知，在置信區(qū)間95%時(shí)，方程線性相關(guān)系數(shù)R= 0.989 1。證明回歸方程真實(shí)、可靠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于替代實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。方程各自變量(Xn)方差分析表明，方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)多糖提取得率具有顯著性影響，因此各因素與響應(yīng)值之間不是簡單的一次關(guān)系。并進(jìn)一步對(duì)回歸方程各項(xiàng)作顯著性檢驗(yàn)。表4  回歸方程各項(xiàng)的顯著性檢驗(yàn)分析（略）由表可知，液料比對(duì)淫羊藿苷提取得率具有顯著性影響，而提取時(shí)間、醇濃度則無顯著性影響。根據(jù)回歸分析結(jié)果作出相應(yīng)曲面圖和等值線圖，見圖13。利用SAS軟件，進(jìn)行分析，得淫羊藿苷的最佳提取工藝條件為：液料比29.71，提取時(shí)間1.78 h，

10、乙醇濃度71.8%，在此條件下淫羊藿苷的理論提取得率為1.14 g/g。結(jié)合實(shí)際操作方便和方差分析結(jié)果，確定最佳提取工藝條件為：加藥材30倍量的70%的乙醇提取1.75 h，共提取兩次。2.2.3   驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)按照最佳提取工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提取3次，測得淫羊藿苷的平均得率為1.36 g/g，RSD為3.51%。結(jié)果見表5。表明該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。表5  驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果（略）3   討論     本研究采用響應(yīng)面分析法對(duì)淫羊藿苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并得到回歸方程。其最佳提取工藝條件為：加藥材30倍量的70%乙醇

11、提取兩次，每次1.75h，結(jié)果淫羊藿苷得率為1.36 g/g。    傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)往往采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)8，尋求最佳的因素水平組合，但不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，從而無法找到整個(gè)區(qū)域上的因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析法是通過中心組合實(shí)驗(yàn)研究幾種實(shí)驗(yàn)因素間相互作用的一種回歸分析方法，具有周期短，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，回歸方程精確度高等優(yōu)點(diǎn)，并能從圖形方面分析尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)考察因素。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面分析法所得淫羊藿苷提取最佳工藝，具有操作方便、重復(fù)性好、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定可行。【】  1周 璐，章巧萍，徐孝平，等

12、生精湯對(duì)雄激素致無排卵模型大鼠卵巢功能及形態(tài)學(xué)的影響J浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，30（6）：6212章巧萍淺談補(bǔ)腎活血法多囊卵巢綜合征J中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(11)：10143黃 菊，羅麗莉，傅玉才，等淫羊藿甙對(duì)大鼠早期卵巢卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞凋亡影響的初步研究J醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（5）：5234劉 娟，朱兆榮，汪江華，等淫羊藿、補(bǔ)骨脂及其復(fù)方提取液的性激素樣作用觀察J中國獸醫(yī)雜志，2003，39(6) ：33 5葉海涌，劉 健，樓宜嘉淫羊藿苷衍生物的制備及其雌激素樣作用研究J浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005，34(2)：1316Carlson R·Designs f