1、PCR SSCP技術綜述摘要：聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)是基于PCR 的單鏈構象多態性分子標記技術。PCR-SSCP作為檢測基因突變的方法，自創立以來，經歷了自身發展和完善的過程。剛建立時是將同位素摻入PCR擴增物中，通過放射自顯影來顯示結果，這給該技術的推廣造成一定的困難。隨著DNA銀染方法與PCR-SSCP結合，尤其是直接溴乙錠染色方法的應用，使得該方法大大簡化，操作更為簡單，局限性較小，實驗條件要求不高，適合一般臨床實驗室使用，具有簡便、快速、靈敏的特點。不但被用于檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，而且還可用于動物育種，微生物，寄生蟲研究的多個領域。由于SSCP的

2、突出的優點，近幾年被大量地應用。文章介紹PCR-SSCP的原理和方法，優點與缺點，技術的優化和應用級展望。關鍵詞：PCR-SSCP；原理；方法；優缺點；展望Abstract：Polymerase chain reaction - single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) is a PCR-based single-strand conformation polymorphism molecular markers. PCR-SSCP as a method to detect gene mutations, since its inc

3、eption, has experienced its own development and improvement process. When is the isotope incorporation newly created objects in the PCR amplification, by autoradiography to show results, which may cause some difficulty to the promotion of the technology. Silver staining DNA with PCR-SSCP method bind

4、ing, especially as a direct method of staining with ethidium bromide so that the simplified method, the operation is simpler, less limitations, the experimental conditions do not ask for general clinical laboratory use, with simple, rapid, sensitive features. Not only is used for detection of gene d

5、eletions and point mutations and insertion of short sequences, but also for animal breeding, microbes, parasites research in many fields. As the outstanding advantages of SSCP, are extensively used in recent years. This paper introduces the principles and methods of PCR-SSCP, advantages and disadvan

6、tages, optimization, and application-level prospect technology.Key word：PCR-SSCP; Principles; method; advantages and disadvantages; outlook基因單核苷酸多態性(SNP)是指基因組中單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性。包括單堿基的轉換、顛換、插入及缺失等形式。DNA分子標記是以個體間核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記。是DNA水平遺傳變異的直接反映。通過對分子標記的深入研究。還將最終達到在DNA水平上直接操縱有益基因的目的。在分子遺傳標記中，單鏈構象多態性(Si

7、ngle-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)技術是最常用的方法之一。它是隨著對人類基因組的研究而發展起來的用于檢測堿基突變的技術。1 聚合酶鏈反應（PCR） Polymerase Chain ReactionPCR技術誕生于1985年，美國Cetus公司人類遺傳室的Kary MullisPCR技術發明者，因此獲1993年諾貝爾化學獎1。1.1 基本原理：在反應溫度為90-95時，DNA變性成為單鏈；反應溫度降至45-65時，兩種引物與兩條單鏈DNA退火而配對結合；反應溫度升至72左右時，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以單鏈DNA為模板逐步延伸成新的單

8、鏈。“ 變性退火延伸”這一循環完成后，DNA復制了一次，由一個DNA分子成為兩個DNA分子。1.2 PCR兩個重要特性：能合成DNA的特定序列；特定序列的大量擴增變性復性的過程1.3 PCR反應組成：Temple DNA、Primer、 4´dNTPs、DNA Taq酶、PCR Buffer引物：是指兩段與待擴增靶DNA序列側翼片段互補的寡核苷酸。長度一般在20-30mer2 PCR-SSCP方法的原理PCRSSCP是一種以PCR為基礎。基于DNA構象差別而進行快速、靈敏、有效檢測基因點突變的方法。其基本原理是經PCR擴增的DNA片段在變性劑或低離子濃度下。經高溫處理使之解鏈并保持在

9、單鏈狀態下，DNA單鏈可折疊成一定空間構象。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時。相同長度DNA單鏈因其堿基序列不同。甚至單個堿基不同，導致形成的構象不同，而且單鏈DNA構象的變化很可能引起了遷移率的改變。每條單鏈處于一定的位置，靶DNA中若發生堿基缺失、插入或單個堿基置換時，就會出現泳動變位，通過顯色或顯影后在凝膠上就會顯示出帶型的差別，即多態性。3 PCR-SSCP的實驗操作2在小于1Kb長度的情況下，DNA片段長度與丙烯酰胺的濃度選擇如下:DNA片段長度(核苷酸數)丙烯酰胺(%)1Kb700b3.5700b500b5500b200b8200b12在進行SSCP前首先要通過PCR擴增出

10、特異性好的產物(瓊脂糖電泳不能有過強的拖尾)。3.1制備聚丙烯酰胺凝膠(PAG) 3按上表制所需的膠液，將梳子插入模子，從梳子一端加入膠，當膠液快到梳齒時，使 模子向加膠端傾斜，繼續慢慢加膠，邊加邊放端模子以防止氣泡形成，室溫放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，頂部加入1×TBE封閉，備用。3.2電泳取10lPCR產物，加入10l變性劑(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚藍)、30l 石蠟油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后將水相全部上樣，10-15下 電泳.開始在300V電壓下電泳5min，然后在120V電泳8h，取下凝膠，將其浸在含 0.5ug

11、/ml溴化錠的1×TBE緩沖液中染色30-45min，在紫外燈下觀察，或進行銀染。3.3銀染法將PAG板用去離子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去離子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去離子水洗3-5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中顯色7min.最后，用0.75%NaCO3終止顯色。4 PCR-SSCP的優缺點4PCR-SSCP作為檢測基因突變的方法，經不斷地改進和完善，變得更為簡便、快速、靈敏、不需要特殊的儀器，適合臨床實驗的需要，適于大樣本篩選。因而具有一定的推廣價值。4.1 優點4.1.1 可以檢測任何(包括已

12、知的和未知的)DNA位點上的多態性和突變，且檢測靈敏性高，能夠檢測出lbp的小缺失和點突變，這大大提高了基因突變的檢測范圍。4.1.2 無需事先知道待測DNA片段的序列。只要能夠根據已有的數據設計PCR引物即可進行PCR- SSCP分析。4.1.3 省去了酶切消化以及核酸雜交等復雜的實驗步驟，操作簡單，不需特殊儀器，技術容易常握，實驗成本低，操作步驟少，周期短，整個過程可在一到兩天內完成。4.1.4 可在測序前對DNA樣本進行篩選，適合于同時對大量樣品進行篩選，特別適用于混合細胞群體中DNA變異的檢測。常規方法在研究基因突變時需DNA測序，SSCP技術在測序前對DNA 樣本進行篩選，從而大大地

13、避免了盲目測序時帶來l 一人力、物力和時間上的浪費。4.1.5 更適宜于對功能基因進行研究。這對動物的功能基因定位有重要意義。4.1.6 PCRSSCP分析對DNA原始材料純度要求不高。且所需量較少，為該技術在研究和實際操作中的應用提供了極大方便 。4.2 缺陷因為PCR-SSCP技術是新近發展起來的一種分子生物學分析方法。所以不可避免會存在一些缺陷。4.2.1 不能對DNA序列變異進行精確的定位。而只能對其進行初篩，需要結合序列分析才能確定變異的置及內容。對大于300bp的DNA片段，隨著DNA片段長度的增加，檢測的敏感性逐漸降低。4.2.2 雖然從理論上講PCR-SSCP法可以檢測任何位點

14、上的堿基變異，但實際應用中可能會遇到相當比例的假陰性結果。在通常的條件下，有些突變可能未被檢出，因而，只通過該技術并不能證明完全沒有突變。4.2.3 PCR-SSCP分析結果受多種因素如電泳溫度、離子強度(即電泳緩沖液濃度)、凝膠濃度、甘油的濃度和交聯劑亞甲基雙丙烯酰胺的濃度等的影響。不同的實驗條件甚至可能導致完全不同的結果。在室溫，通風冷卻條件下電泳，少量片段的條帶難以分離。盡管如此，該方法和其他方法相比仍有較高的檢測率。首先，它可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Havashi5經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，99可通過SSCP發現，對于300450bp片段的靈敏

15、度為89 ，因此他認為現在知道的所有單堿基改變絕大多數可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離。并且還可以進一步提純，用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。再者，PCR-SSCP能靈敏地檢測出基因中任何部位導致DNA構象改變的突變基因。為檢測某個全長基因的多態性提供了有效方法。借助已構建的物理圖譜和遺傳圖譜，該技術可將更多的位點納人連鎖、數量性狀位點(QTL)分析和標記輔助選擇分析中。5 SSCP5.1的原理及特點6日本Orita等研究發現，單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部堿基配對等分子內相互

16、作用力來維持的，當有一個堿基發生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開。作者稱該方法為單鏈構象多態性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。在隨后的研究中，作者又將SSCP用于檢查PCR擴增產物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP技術，進一步提高了檢測突變方法的簡便性和靈敏性。其基本過程是：PCR擴增靶DNA；將特異的PCR擴增 產物變性，而后快速復性，使之成為具有一定

17、空間結構的單鏈DNA分子；將適量的單 鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結果。若發現單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發生改變，就可以判定該鏈構象發生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特 殊的儀器，適合臨床實驗的需要。但它也有不足之處.例如，只能作為一種突變檢測方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進一步測序；電泳條件要求較嚴格；另外，由 于SSCP是依據點突變引起單鏈DNA分子立體構象的改變來實現電泳分離的，這樣就可能會出現當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小時，再加上其他條件的

18、影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢，盡管如此該方法和其他方法相比仍有較高的檢測率。首先，它可以發現靶DNA片段中未知位置的堿 基突變。Takao，經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單堿基改變絕大多數可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純，用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。5.2 SSCP的不斷改進7SSCP技術自創立以來，經歷了自身發展和完善的過程，剛建立時是將同位素摻入PCR 擴增物中，通過放射自顯影來顯示結果。這給該技術的

19、推廣造成一定的困難，隨著DNA 銀染方法與PCR-SSCP結合，尤其是直接溴乙錠染色方法的應用，使得該方法大大簡化。最近，SSCP值得注意的改進是將DNA-SSCP分析，改為RNA-SSCP分析，其基本原理是：RNA有著更多精細的二級和三級構象，這些構象對單個堿基的突變很敏感，從而提高了檢出率，其突變檢出率可達90%以上。另外，RNA不易結合成雙鏈，因此可以較大量的進行電泳，有利于用溴化乙錠染色.但該方法增加了一個反轉錄過程；還需要一個較長的引物，內含有啟動RNA聚合酶的啟動序列，從而相對地增加了該方法的難度。為了進一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測方法相結合。其中與雜交

20、雙鏈分析(Heterocluplex analysis，Het)法結合可以大大提高檢出率。Het法是用探針與要檢測的單鏈DNA或RNA進行雜交，含有一對堿基對錯配的雜交鏈可以和完全互補的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被分離開。對同一靶序列分別進行SSCP和Het 分析可以使點突變的檢出率接近100%，而且實驗簡便。5.3 SSCP注意的事項8SSCP是一種快速、簡便、靈敏的檢測基因突變的方法，為了使SSCP達到最佳效果，應 注意下列事項。5.3.1重復性：影響SSCP重復性的主要因素為電泳的電壓和溫度，這兩個條件保持不變， SSCP圖譜可保持良好的重復性。一般SSCP圖譜是二條單鏈DNA帶

21、，但有時有的DNA片段 可能只呈現一條SSDNA帶，或者三條以上，這主要是由于兩條單鏈DNA之間存在相似的立體構象。有時三條以上的SSCP圖譜是由于野型DNA片段和突變型DNA片段共同存在的結果。5.3.2靶DNA序列長度的影響在實驗中發現SSCP對短鏈DNA或RNA的點突變檢出率要比長鏈的高，這可能是由于長鏈DNA和RNA分子中單個堿基的改變在維持立體構象中起的作用較小的緣故.而有人認為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下，DNA的長度不會影響SSCP 的效果。他們仔細選擇了實驗條件，發現354bp的DNA中點突變的檢出率仍可達到90%以上。5.3.3電泳電壓和溫度的影響:為了使單鏈DN

22、A保持一定的穩定立體構象，SSCP應在較低溫度下進行(一般4-15之間).在電泳過程中除環境溫度外，電壓過高也是引起溫度升高的主要原因。因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進行SSCP時，開始的5min應用較高的電壓(250V)，以后用100V左右電壓進行電泳。這主要是由于開始的高電壓可以使不同立體構象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會升高，隨后的低電壓電泳可以使之進一步分離。在實驗中應根據具體實驗條件確定電泳電壓。5.3.4 DNA片段中點突變的位置對SSCP的影響點突變在DNA和RNA中的位置對SSCP檢測率的影響，取決于該位置對維持立體構象作用的大小，而不是僅僅取決于點突變在DNA鏈上的位

23、置(有人認為點突變在DNA鏈中部要比在近端部容易被SSCP檢測出來)。White曾設計了一組樣品DNA片段，并將其中的點突變設在DNA鏈的中部，而且該點又正處在發夾結構頂端的環上，結果發現SSCP只能檢測出9個樣品中的2個(檢出率為22%)，說明DNA鏈中任何部位的突變，只要對其單鏈立體構象沒有影響，都有可能被漏檢。5.3.5 SSCP的結果斷定:由于在SSCP分析中非變性PAG電泳不是根據單鏈DNA分子和帶電量的大小來分離的，而是以單鏈DNA片段空間構象的立體位阻大小來實現分離的，因 此，這種分離不能反映出分子量的大小。有時正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難看出兩者之間的差別，因此一般要求電

24、泳長度在16-18cm以上，以檢測限為指標來判定結果.檢測限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值，大于檢測限則判定鏈的遷移率有改變，說明該DNA序列有變化，小于檢測限則說明鏈之間無變化。6 PCR-SSCP的發展現狀9隨著分子生物學技術的發展，檢測基因結構和突變的方法不斷涌現.尤其是PCR技術問世以后，各種與PCR相結合的基因檢測技術進一步推動了基因研究的發展。如不對稱 PCR產物的直接測序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段長度多態性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等已成為基因分析的有力工具.但這些方法操作比較繁瑣，局限性較大，或要求實驗條件高，不適合一般臨床實驗室使用。1989年問世的PCR-SSCP(下文稱SSCP)作為檢測基因 突變的方法，經不斷地改進和完善，更為簡便、快速、靈敏，不但用于檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，而且還被用于DNA定量分析，監測PCR診斷實驗中的交叉污染情況，